大豆在暗誘導下光周期及衰老相關基因的差異表達研究

定　價：￥25.00

作　者：	趙琳著
出版社：	中國農業(yè)科學技術出版社
叢編項：
標　簽：	農作物

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ISBN：	9787802338692	出版時間：	2009-05-01	包裝：	平裝
開本：	大32開	頁數：	180	字數：

內容簡介

　　《大豆在暗誘導下光周期及衰老相關基因的差異表達研究》講述了：黑龍江省是我國大豆主要生產基地，加入世貿組織后，大豆面臨嚴重的進口壓力。主要原因是我國大豆單產低，競爭力不強。大豆屬于短日照植物，其生長發(fā)育對光周期反應非常敏感，這一特性嚴重阻礙大豆品種的適應性，是制約大豆單產提高和穩(wěn)產的關鍵因素。暗處理相當于短日照，可以縮短大豆的開花和成熟期，其表型之一是加速葉片的衰老。葉細胞的結構、代謝和基因表達都協(xié)調的發(fā)生變化，細胞器官的組分被依次有序的分解。代謝變化包括合成代謝活性的減弱，如光合作用和蛋白質的合成，以及分解代謝的加速，如核酸降解和蛋白水解。這些對維持植物生長和生殖是非常必要的，基因轉錄物豐度的巨大變化揭示了從有光合活性的葉片到作為流動營養(yǎng)物來源的衰老器官來維持發(fā)育的轉變情況。為了打破大豆種植區(qū)域的局限性，本研究在細胞分子水平上從基因差異表達的角度研究短日照光周期誘導開花和衰老過程中基因轉錄豐度的變化，克隆與大豆光周期反應及衰老有關的基因，從而探索大豆葉片感受日長變化誘導開花和衰老的復雜機制。雖然植物花器官的分化發(fā)生在頂端分生組織，在開花過程中的基因表達也必然在頂端分生組織中有所反映，然而植物感受光的器官是葉片，并利用長距離信號通過韌皮部傳導至頂端分生組織（SAM）影響生殖生長，在光周期控制開花過程中也必然牽涉葉片中很多基因的互作。由于黑暗的長度是開花時間的關鍵決定因素，在光周期控制開花過程中基因可能在夜間表達有差異，所以，以晝夜交替時的大豆的兩個樣本的葉片為研究目的對象，構建了差異表達的cDNA消減文庫，發(fā)現(xiàn)與暗誘導相關的差異表達基因，揭示了有關參與機體暗適應下蛋白質的上調表達的信息，為進一步分離暗處理產生差異表達基因奠定了基礎。通過轉化短日照煙草，進行光周期反應基因的功能驗證，分析該類基因在光周期反應中的作用。同時，研究外源激素的施加對光周期途徑相關轉錄因子基因表達的影響；分析開花誘導中基因組織特性的表達情況。本研究的宗旨是通過基因的克隆和改造，試圖從根本上改變大豆對光的敏感性，為大豆高產穩(wěn)產提高尋找新的突破口，從根本上扭轉我國大豆依賴于進口的被動局面。主要結果如下。1.本試驗首次應用抑制性消減雜交（SSH）技術以東農u3大豆的短日照（8h光/16h暗）和長日照（16h光/8h暗）兩個樣本為研究目的對象，構建了含有1738個克隆的差異表達的cI）NA消減文庫，對148個克隆進行測序，在此基礎上發(fā)現(xiàn)了76個與暗誘導相關的差異表達ESTs（上調至少3倍），根據Blastn和Blastx推測這些ESTs的功能包括參與轉錄、信號轉導和細胞凋亡的調節(jié)類蛋白；參與大分子降解的酶類如蛋白和核酸的降解、參與細胞壁修飾的合成代謝、初級代謝以及次級代謝的酶類和解毒與防衛(wèi)的壓力反應的基因。揭示了有關參與機體暗適應下蛋白質的上調表達的信息，為進一步分離短日處理產生差異表達基因奠定了基礎。2.為了研究GmRAV在大豆短日照信號轉導中的可能作用，我們利用cDNA末端快速擴增（RACE）技術從大豆中克隆了編碼GmRAv的cDNA序列。序列分析結果表明，GmRAV基因編碼351個氨基酸，含有AP2/ERF和B3結構域，GenBank登陸號為DQ147914，其DNA序列與辣椒、水稻和擬南芥RAV基因高度同源。3.Real-time RT-PCR分析在短日照和長日照條件下大豆葉片中GmRAV基因mRNA轉錄物的豐度變化，表明該基因的豐度在短日照（SD）時都要顯著高于在長日照（LD）條件下的豐度。4.分析GmRAV基因在不同組織中mRNA轉錄物的豐度變化表明，SD強烈誘導GmRAV基因在葉、根和莖中的表達。5.構建了植物表達載體pBI121-GmRAV，用農桿菌介導法轉化煙草過量表達該基因，獲得卡那霉素抗性植株54株。PCR方法鑒定Tn轉基因株系，獲得18個轉基因的PCR陽性植株。通過Northern分析表明這4株轉基因煙草中的GmRAV基因都轉錄，表明它們都已成功轉入煙草中，并正常表達。6.GmRAV過量表達的煙草植株與對照相比無論在長日照和短日照下植株都明顯矮小，節(jié)間距短，節(jié)數少，并且在土壤中生長時葉片更深綠，葉片小，GmRAV過量表達對莖和葉的發(fā)育以及植株的生長有推遲抑制作用。轉大豆GmRAV基因的煙草植株無論在長日照和短日照條件下均表現(xiàn)出開花延遲的特征，并且光周期敏感性增強，非轉基因煙草在長日照比短日照條件下開花提前3天，而GmRAV過表達的煙草植株在長日照比短日照條件下開花卻提前13天。7.GmRAV是BR信號轉導途徑的抑制因子，GmRAV基因通過抑制BR信號而抑制植物細胞伸長從而抑制生長，導致轉基因植株矮化。8.GmRAV是GA生長信號轉導途徑中的促進因子，是ABA和黑暗促進衰老途徑中的促進因子。

作者簡介

　　趙琳（1980- ），女，黑龍江省鶴崗市人，博士，助理研究員。主要從事大豆生物技術研究，2007年至今工作于東北農業(yè)大學農學院/大豆生物學省部共建教育部重點實驗室。在利用抑制性消減雜交技術尋找差異表達基因、基因克隆、生物信息學、植物組織培養(yǎng)、轉基因及轉基因品種培育研究方面取得一定的成績。

圖書目錄

1 引言
1.1 植物開花機理的研究進展
1.1.1 植物花芽分化過程的調節(jié)機制
1.1.2 環(huán)境條件對植物成花的調控
1.2 大豆光周期現(xiàn)象的研究進展
1.2.1 大豆生育期性狀的光周期反應特性
1.2.2 光周期對大豆農藝性狀和籽粒品質的影響
1.2.3 大豆中光敏感性E等位基因的研究進展
1.2.4 大豆開花時間基因圖譜的繪制
1.3 擬南芥開花誘導的分子生物學研究進展
1.3.1 光周期途徑
1.3.2 春化促進途徑
1.3.3 自主途徑
1.3.4 赤霉素途徑
1.3.5 染色質結構和開花抑制
1.3.6 擬南芥開花途徑的整合
1.3.7 植物中的擬南芥開花途徑的基因保守性
1.4 植物衰老的研究
1.4.1 衰老的生理生化反應特性
1.4.2 衰老學說
1.4.3 衰老的調控
1.5 RAV轉錄因子的研究進展
1.6 基因差異表達的研究方法
1.6.1 基于cDNA的PCR擴增方法
1.6.2 基于差減雜交的克隆方法
1.6.3 表達序列標簽
1.6.4 基因表達系列分析
1.6.5 微陣列雜交
1.6.6 實時熒光定量PCR技術
1.7 植物遺傳轉化
1.7.1 植物遺傳轉化方法
1.8 研究目的和意義
2 材料和方法
2.1 實驗材料和試劑
2.1.1 植物材料
2.1.2 菌種及載體
2.1.3 主要試劑
2.2實驗方法
2.2.1 抑制性消減雜交(SSH)
2.2.2 抑制消減文庫的構建
2.2.3 反向Northem blot斑點雜交篩選消減文庫
2.2.4 測序及序列同源性檢索
2.2.5 實時熒光定量PCR進一步驗證差異表達的片段
2.2.6 RACE方法克隆大豆GmRAV基因
2.2.7 Real-time RT-PCR分析GmRAV的表達
2.2.8 植物表達載體pBI121-GmRAV的構建
2.2.9 農桿菌介導法轉化煙草葉盤
2.2.10 轉基因煙草的分子生物學檢測
2.2.11 轉GmRAV基因煙草T2代功能分析
3 結果與分析
3.1 抑制性消減雜交(SSH)
3.1.1 大豆總RNA的提取
3.1.2 SMART技術合成cDNA
3.1.3 雙鏈cDNA的Rsal酶切結果
3.1.4 正向差減產物的PCR擴增結果
3.1.5 反向Northern斑點雜交篩選結果
3.1.6 測序與同源性檢索結果
3.1.7 候選cDNA片段差異表達檢測分析結果
3.1.8 基因功能相關分析
3.2 大豆GmRAV基因克隆
3.2.1 大豆GmRAV基因5'RACE和3'RACE克隆
3.2.2 大豆GmRAV基因全長序列的生物信息學及系統(tǒng)進化分析
3.2.3 GmRAV全長基因組DNA序列的獲得
3.3 大豆GmRAV基因表達研究
3.3.1 大豆葉片中GmRAV基因在LD和SD條件下基因表達
3.3.2 大豆GmRAV基因在LD和SD條件下組織特異性表達分析
3.3.3 激素對大豆葉片中GmRAV基因的表達影響
3.4 植物表達載體pBI121-GmRAV的構建
3.5 煙草的遺傳轉化
3.5.1 叢生芽和根的誘導
3.5.2 轉基因煙草的PCR檢測
3.5.3 轉基因煙草的PCR-Southem檢測
3.5.4 轉基因煙草的Nortthem blot檢測
3.5.5 長日照和短日照下轉基因煙草的T2代表型觀察
3.5.6 轉GmRAV基因煙草植株矮化與BR和GA激素有關
3.5.7 過量表達GmRAV增強了ABA促進葉片衰老的效應
3.5.8 暗處理下GmRAV過量表達加速植株的衰老
4 討論
4.1 光周期和衰老相關基因表達譜分析
4.2 光周期和衰老相關基因的克隆
4.3 植物表達載體的構建及煙草的遺傳轉化
4.3.1 采用農桿菌轉化植物的優(yōu)勢
4.3.2 轉化農桿菌及其鑒定
4.3.3 用于轉化的農桿菌的培養(yǎng)
4.3.4 葉盤法轉化煙草
5 結論
參考文獻
附錄
攻讀學位期間發(fā)表的學術論文
圖版