芽孢桿菌抗菌脂肽及其生物合成調控

第1章緒論001
1.1芽孢桿菌抗菌脂肽研究進展002
1.1.1脂肽的種類、結構與合成002
1.1.2抗菌肽合成的代謝調節(jié)007
1.1.3脂肽的功能及應用011
1.2基因組改組研究進展013
1.2.1基因組改組的原理013
1.2.2基因組改組的技術路線014
1.2.3基因組改組的應用016
1.2.4基因改組技術展望019
1.3蛋白質組學研究技術019
1.3.1蛋白質組學的分類020
1.3.2蛋白質組學的應用021
1.3.3蛋白質組學的研究策略022
1.3.4蛋白質組學技術面臨的問題024
1.4本研究的主要工作024
1.4.1研究目的和意義024
1.4.2研究的主要內(nèi)容025

第2章淀粉液化芽孢桿菌理化誘變選育surfactin高產(chǎn)菌株026
2.1材料027
2.1.1儀器設備027
2.1.2菌種028
2.1.3培養(yǎng)基與溶液028
2.2理化誘變與篩選方法029
2.2.1誘變方法029
2.2.2篩選方法031
2.2.3高效液相色譜（HPLC）測定脂肽含量032
2.2.4抗菌脂肽產(chǎn)量計算方法032
2.3選育結果與分析032
2.3.1紫外誘變032
2.3.2NTG誘變033
2.3.3離子束誘變035
2.4討論036
2.5本章小結036

第3章基因組改組選育淀粉液化芽孢桿菌surfactin高產(chǎn)菌株038
3.1材料039
3.1.1儀器設備039
3.1.2菌種040
3.1.3培養(yǎng)基與溶液040
3.2基因組改組實驗方法040
3.2.1菌種保存040
3.2.2菌種初級誘變041
3.2.3原生質體的制備、滅活、再生與融合041
3.2.4基因組改組042
3.2.5surfactin產(chǎn)量測定043
3.3結果與分析043
3.3.1初始菌株的篩選043
3.3.2原生質體的制備條件研究043
3.3.3原生質體滅活條件研究047
3.3.4融合條件研究048
3.3.5融合子的挑選050
3.3.6基因組改組050
3.3.7菌株搖瓶發(fā)酵比較051
3.3.8FMB38的遺傳穩(wěn)定性052
3.3.9原始菌株（ES-2-4）與改組菌株（FMB38）在發(fā)酵罐中發(fā)酵性能比較053
3.4討論054
3.5本章小結056

第4章實時熒光定量PCR檢測突變菌株FMB38脂肽合成酶基因表達057
4.1材料058
4.1.1試劑058
4.1.2菌種058
4.1.3儀器設備059
4.2突變檢測方法059
4.2.1引物設計059
4.2.2RNA提取前的實驗準備059
4.2.3RNA提取060
4.2.4RNA質量檢測鑒定060
4.2.5反轉錄PCR061
4.2.6熒光定量PCR061
4.2.7樣本表達量的標準化062
4.3結果與分析062
4.3.1RNA提取062
4.3.2目的基因與內(nèi)參基因qRTPCR擴增063
4.3.3樣本中靶基因的相對定量063
4.4討論065
4.5本章小結066

第5章抗菌脂肽高產(chǎn)突變菌株FMB38差異蛋白質組學研究067
5.1材料068
5.1.1試劑及溶液068
5.1.2菌種069
5.1.3儀器設備070
5.2差異蛋白質組學研究070
5.2.1樣品收集070
5.2.2全蛋白提取和定量070
5.2.3雙向電泳071
5.2.4凝膠染色072
5.2.5圖像采集及圖譜分析073
5.2.6膠內(nèi)酶解、質譜鑒定074
5.2.7數(shù)據(jù)庫查詢075
5.2.8生物信息學分析075
5.3結果與分析075
5.3.1雙向電泳體系的建立075
5.3.2差異表達蛋白質的鑒定080
5.3.3蛋白質等電點和分子量分析085
5.3.4蛋白質的細胞定位分析086
5.3.5實驗鑒定差異蛋白質分類與功能分析086
5.3.6幾個差異蛋白點的肽質量指紋圖譜分析091
5.4討論098
5.4.1質譜分析098
5.4.2蛋白質翻譯后修飾099
5.4.3與surfactin合成有關的蛋白099
5.4.4與代謝有關的蛋白質100
5.4.5能量產(chǎn)生與轉化相關蛋白102
5.4.6DNA復制、重組和修復相關蛋白102
5.4.7翻譯及翻譯后修飾相關蛋白103
5.4.8與信號傳導機制等有關的蛋白104
5.4.9假想蛋白與未知蛋白104
5.5本章小結105

第6章抗菌脂肽fengycin生物合成調控機理研究106
6.1材料107
6.1.1菌種107
6.1.2培養(yǎng)基與試劑107
6.1.3儀器設備108
6.2fengycin生物合成調控研究109
6.2.1篩選方法109
6.2.2高效液相色譜檢測脂肽含量110
6.2.3抗菌脂肽產(chǎn)量計算方法110
6.2.4原始菌株的初級誘變111
6.2.5基因組改組112
6.2.6遺傳穩(wěn)定性試驗112
6.2.7熒光定量PCR檢測fengycin合成酶基因113
6.2.8蛋白質組學113
6.3結果與分析113
6.3.1初始菌株的篩選113
6.3.2基因組改組115
6.3.3FMB72遺傳穩(wěn)定性116
6.3.4fengycin產(chǎn)生菌生物學特性及發(fā)酵條件研究117
6.3.5靶基因fenA的相對定量118
6.3.6差異蛋白質組學相關研究119
6.3.7fengycin合成調控因子相關研究125
6.4討論125
6.5本章小結127

第7章總結與展望129
7.1surfactin研究130
7.2fengycin研究130
7.3未來研究展望131

參考文獻133